這個照片很多colonies沒在焦平面上
而且不知道你染色的方法是? 很多colonies旁邊有一圈halo
你是用INT之類去染活細胞嗎? 染色染太久了嗎?
以前我算3D mammalian cell colonies in soft agar
是用DSLR縮光圈拍 這樣整層soft agar的所有colonies都清楚
一般的gel camera光圈都太大 景深很淺 焦平面外的colonies模糊
千萬別用顯微鏡拍 因為生物顯微鏡鏡頭景深太淺 working distance也不夠遠
就算是2X物鏡 0.5X延伸筒接相機
加上高階相機(full frame)也沒有機會拍下整個6-well
電子業常見的inspection microscope可能是個好選擇
或許dissecting microscope也可以 但相機(面積)要夠大
而且低階的dissecting microscope視野周邊通常變形嚴重 你可以試試看啦
拍攝的彩圖(灰階照片亦可)匯到Iamge J去數
Image J的步驟是:
1. 圓形圈選工具手動圈選well範圍
(離well邊緣留下一點餘地不選 因為well的陰影容易造成後續binnary誤判)
2. 留下圈選的well 去除圈選範圍外面的區域
3. Binnary工具將照片改成黑白 (black and white)
4. Watershed工具分離相鄰的colonies
5. 用counting工具 自動計算colony數目 匯出colony number，size，及area %
(我會調整計算的colony大小範圍 e.g. pixel^2 可以過濾染色雜訊)
※ 引述《spongeJa (化學最帥)》之銘言：
: 如題，
: 最近被丟了兩大疊加藥後的細胞照片
: 想用Image J來自動計數細胞（比較有效率）
: 但附近的人都沒有人會使用
: 有爬文看教程，但實際操作起來就是很怪
: 沒辦法像學長一個一個慢慢點出來的數量一樣正確
: （他點900多，我用Image J跑出來600多）
: 不知道是不是因為沒有用顯微鏡去拍照
: 導致畫面不平整、細胞沒辦法完整呈現出來
: 拜託各位大神救援一下QQ
: （這是其中一盤的照片）
: https://i.imgur.com/ALF1krs.jpg
: 感謝！！